CART细胞疗法中的肿瘤抗原逃逸

01

介绍

CART细胞正在改变对复发性和难治性B细胞恶性肿瘤患者的护理。早期临床试验证明了强大的疗效，因此FDA批准了四·种CART细胞产品。然而，对接受基于CAR的B细胞恶性肿瘤治疗的患者的仔细随访表明，由于获得性肿瘤耐药性，治疗后复发率很高。最常见的是，CART细胞的免疫压力通过调节其靶抗原的表达来驱动癌症进化，方法是丢失可检测的抗原或将抗原表达降低至低于CART细胞活性所需的阈值。

本文主要通过抗原阴性/低变异体的出现回顾了肿瘤对CAR疗法耐药的证据，并讨论了可以采取的克服这一问题的方法。介绍思路如图所示：

02

抗原丢失

（1）临床数据

CD19CART细胞治疗儿科B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的I期试验的初步报告表明，反应率为70%至90%(8-10)，在成人中也观察到了同样令人印象深刻的结果(11,14,15)。然而，这些反应的持久性有时会受到CD19阴性白血病生长的限制，尤其是在CART细胞长期存在的患者中。

医院(CHOP)首次发表了一项CD19-4-1BB-ζCAR治疗儿科B-ALL的I期试验，27名应答者中有3名(11%)出现白血病复发，但未检测到CD19(8）。CHOP的摘要对这些初始患者进行了更长的随访，其中还包括其他接受治疗的患者，报告称55名获得CR的患者中有13名(24%)经历CD19阴性复发(19)。

在诺华tisagenlecleucel的一项全球II期试验中，在以CD19表达为特征的16例复发中，15例被证明是CD19阴性的。在有限的随访中，61名完全缓解者中至少有15名(25%)继续发展为CD19阴性或部分阴性复发，另外6次复发未分析CD19表达（17）。

在西雅图儿童研究所(SCRI)的一项针对B-ALL的类似CD19-4-1BB-ζCAR的临床试验中，40名获得CR的患者中有7名(18%)后来因CD19缺失而复发(10)。

NCI在儿科患者中进行的CD19-CD28-ζCAR试验的特点是T细胞持续时间较短，患者经常在CAR治疗后接受造血干细胞移植(HSCT)，但12名达到最小残留的患者中有2名疾病(MRD)阴性反应也发展为CD19阴性B-ALL（患者均未接受HSCT；参考文献9）。一份包含NCI研究扩展队列的摘要形式的随访报告表明，CAR后MRD阴性的28名患者中有5名(18%)最终复发，CD19表达降低，包括一些在HSCT后复发的患者(20）。

来自成人B-ALLCAR后复发的数据很少：FredHutchinson癌症中心(FHCC)的CD19-4-1BB-ζCAR的I期试验发现29名患者中有2名(7%)CD19阴性复发谁获得了CR(11)。

B-ALL的CD19CAR试验中CD19阴性复发率的总结见表1，但在比较不同研究时应谨慎，因为它们在随访期间差异很大。

总之，虽然CD19阴性逃逸是B-ALL的CD19-CAR治疗后复发的主要原因，但这种现象的真实发生率尚未确定，预测CD19阴性复发可能性增加的因素知之甚少.尽管如此，随着CD19CARs和blinatumomab的CD19定向免疫疗法的应用增长，很明显CD19阴性B-ALL的临床影响也会增加。

表1.ALL的CD19CAR试验中抗原逃逸的总结

（2）抗原丢失的机制

鉴于CD19CAR在儿科B-ALL中的大量临床经验，大多数关于抗原丢失机制的数据来自这些试验中患者样本的研究。迄今为止，已发表的数据表明CD19丢失是通过两种不同的机制发生的：抗原逃逸或谱系转换。

图1肿瘤抗原逃逸机制。CART细胞在癌细胞上遇到足够数量的靶表面抗原，激活并杀死靶细胞。肿瘤细胞可以通过表达缺乏CART细胞识别的细胞外表位的靶抗原的替代形式（“抗原逃逸”），通过切换到遗传相关但表型不同的疾病（“谱系转换”），或通过下调表面靶抗原水平低于CART细胞激活所需的水平（“抗原下调”）。

CHOP的小组描述了导致CD19CAR后B-ALL儿科患者中至少部分抗原逃逸的机制。Sotillo及其同事发现了B-ALL表达的几种CD19剪接变体，包括Δexon-2，它特别缺乏包含FMC63识别的CD19细胞外表位的外显子（CHOP-宾夕法尼亚大学/诺华，NCI/Kite，FHCC-SCRI/Juno-JCAR)和SJ25C1(MSKCC/Juno-JCAR)抗CD19结合剂。此外，他们观察到变体Δexon-5,6，它缺乏CD19的跨膜结构域，因此导致表面表达的丧失。CD19CAR的免疫压力导致选择表达更高比例的这些剪接变体的白血病细胞，从而逃避CD19CART细胞的检测(32)。最近的工作表明，ALL患者在诊断时已经表达CD19剪接变体，因此抗CD19治疗可能只是选择表达这些CD19替代形式的细胞(35)。这种机制并不能解释保留B-ALL表型的细胞中CD19丢失的所有情况，其他机制值得探索(36)。例如，一个小组报告了一名患者丢失CD81，CD19的伴侣蛋白，作为blinatumomab后CD19丢失的机制(37)。

谱系转换是临床试验中观察到的CD19丢失的另一种机制(33)。最常见于MLL重排的患者，例如B-ALL婴儿，当白血病表型响应CD19定向免疫疗法从淋巴样变为髓样时，就会发生谱系转换。进化的白血病群体不仅不再表达CD19，而且还获得了AML的其他表型特征。这在2名在SCRI试验中接受CD19CAR治疗的MLL重排ALL儿科患者和一名成人在FHCC的CD19CAR试验中观察到(11)。此外，Jacoby及其同事在小鼠白血病中模拟了这种现象，他们证明CD19CAR在依赖E2a:PBX转基因的小鼠ALL模型中诱导谱系转换，与MLL重排一样，它可以驱动淋巴或髓系肿瘤(36)。使用blinatumomab进行CD19定向治疗后，MLL重排和非重排患者也发生了谱系转换(38-40)。类似地，已经报道了一例在CD19CAR治疗后转化为克隆相关浆母细胞淋巴瘤的CLL病例(41)。

（3）克服抗原损失的策略

描述CD19抗原丢失所涉及的多种机制表明，创建CAR以靶向CD19上的替代表位可能无效，因为许多例子都涉及CD19表面表达的丢失。数据还表明，无论是CD19-CAR还是blinatumomab介导的T细胞杀伤，都不能有效诱导对B-ALL上共存免疫原性靶标的免疫反应，有时也称为“表位扩散”。这可能反映了B-ALL中相对较低的肿瘤突变负荷，这可能限制了该疾病的固有免疫原性。

将CART细胞与放射(46)、检查点抑制(47-49)、疫苗(50,51)或其他免疫激动剂(34,52)结合使用可能会导致表位扩散，有助于对抗免疫逃逸，我们预计随着该领域的成熟，此类研究将会出现。

克服CART细胞治疗后抗原丢失的另一种方法是同时针对癌细胞上的一种以上抗原，鉴于CD22CART细胞也已显示出显着的临床疗效，这种方法对B-ALL很有说服力(53)。有多种方法可以设计具有多特异性的T细胞产品（图2）。针对不同CAR分别转导的T细胞产物可以同时或依次给药（“共同给药”；图2；参考文献54），或者可以在细胞生产过程中组合两种CAR的载体，以实现与某些细胞的混合产物单个CAR呈阳性，其他两种CAR呈阳性（“共转导”；图2）。这些方法的缺点是生产多个载体的成本高，输注产品的异质性，这会使临床分析复杂化。

图2工程化CART细胞多特异性。

CAR分子本身也可以被设计成识别多种抗原。这可以通过将两个结合剂连接到单个分子上来实现（“串联CAR”；图2），在某些情况下，这似乎可以增强免疫突触的强度。在设计所谓的串联CAR时，目标抗原的位置应该决定每个结合剂相对于膜的取向。例如，在一项串联CD19-CD20双特异性CAR的研究中，作者发现，鉴于CD20位于细胞膜的近端，抗CD20ScFv需要位于CAR分子的远端位置(56)。

多项临床试验正在进行中，以测试多特异性CART细胞。我们最近报道了一种针对CD19和CD22的串联CAR(53)，目前正在儿童和成人的临床试验中（NCT、NCT和NCT），其他研究小组已经生成了针对CD19和CD20的串联CAR，其中之一目前正在人体中进行测试（NCT）。目前正在一项针对CD19和CD22的儿科B-ALL临床试验（NCT）探索混合产品方法。最近提交了一份关于识别CD19、CD20和CD22的三特异性CAR的摘要(60)。此外，一组报告了双特异性CD19和CDCAR的目的是克服抗原逃逸和谱系转换，因为CD在造血区室中广泛表达(61)，尽管预计这种药物会引起大量的造血毒性（62)。我们预计近期内将有越来越多的试验测试能够同时靶向两种或多种抗原的CAR。

03

抗原密度降低

（1）临床数据

认识到单一抗原靶向在许多儿科B-ALL病例中不太可能成功，我们开发了一种靶向CD22的CAR，CD22是另一种在淋巴母细胞上广泛表达的B细胞抗原（63）。在B-ALL中该CAR的首次临床试验中，我们观察到CD19阴性和CD19阳性疾病患者的高缓解率。然而，获得CR的12名患者中有8名(67%)在CD22-CAR输注后12个月内复发，在复发时，7名患者的CD22表达仍保留，尽管水平低于CD22-CAR时观察到的水平治疗。CD22表达的减少未伴随基因组水平的任何检测到的突变或CD22mRNA的表达减少，表明CD22表达的下调发生在转录后水平。在一些患者中，在骨髓中发现了CD22-low淋巴母细胞和持久性抗CD22-CART细胞，表明CAR无法有效消除CD22-low细胞(53)。这通过产生具有可变CD22表达水平的白血病细胞系得到进一步证明，并直接证明CD22CAR在异种移植模型中产生细胞因子和控制肿瘤细胞的能力非常依赖于CD22的表面表达水平。

然而，这种逃逸机制与有关CART细胞激活要求的大量新兴数据一致。我们和其他人已经证明需要高靶抗原密度，以便CAR完全激活并发挥体内活性（64-66）。

最佳CART细胞活性需要高靶抗原水平的生物学基础仍未完全了解，但可能反映了CAR受体识别抗原性质的局限性（图1）。天然TCR能够识别低密度的抗原，因此很容易推测抗原密度要求的差异可能源于天然TCR和CAR之间结构的巨大差异。

抗原结合本身的性质在TCR和CAR受体之间存在很大差异，因为TCR是低亲和力结合剂（Kd在微摩尔范围内），而纳入大多数CAR的scFv以非常高的亲和力识别抗原（Kd在纳摩尔范围内）。与天然TCR相比，这些差异可能会显着影响在表达CAR的T细胞中诱导的反应质量，但这些差异的全部范围仍未完全表征。

认识到CAR需要高抗原表达才能发挥重要作用，这对这些实体瘤疗法的未来发展具有许多意义。鉴于几乎所有计划进行CART细胞临床试验的实体瘤靶点都是异质表达的，随着靶向实体瘤的单特异性CAR变得更加有效，临床成功可能会受到限制快速选择抗原低变异。用于AML的CAR面临类似的障碍。或者，CART细胞对高抗原密度的需求也开启了基于恶性和非恶性组织之间差异靶抗原密度的治疗窗口的可能性。

此外，Ahmed及其同事此后使用递增剂量的HER2-CD28-ζCART细胞治疗肉瘤患者，并证明了安全性和临床疗效的初步迹象，包括在其骨髓横纹肌肉瘤患者中获得CR（82，83)。总之，临床经验与模型最一致，即肿瘤和正常组织之间HER2靶抗原的差异表达为安全性提供了治疗窗口，这与对高抗原密度以获得体内最佳CAR活性的新认识一致。

(2)克服低抗原密度

对于肿瘤和正常组织之间靶抗原差异表达较高的合适靶点，我们预测通过改造CART细胞以响应较低的抗原密度，CAR疗法的疗效将得到增强。

一种方法是用增加靶抗原表达的药剂治疗患者。在临床前研究中，这种方法已采用全反式视黄酸来增加AML中叶酸受体β的表达(84)，并且NCI的研究人员发现苔藓抑素可以增加白血病细胞上CD22的表达，这可能导致提高CD22CAR的功效或预防CD22低变体的生长(85,86)。

或者，CAR工程可用于增强针对较低抗原密度的活性。最常尝试的修改是增强ScFv对其目标的亲和力。对于某些CAR，似乎改变亲和力会导致识别较低水平的目标抗原。两组已经证明，改变EGFR和/或HER2CAR的亲和力可导致T细胞或多或少识别正常组织上可能表达的较低水平的抗原（87、88）；然而，目前尚不清楚增强scFv活性的影响是否达到稳定水平。这表明增加两种不同CD22CAR的亲和力不会导致功能增强(63,85)。

04

结论

B细胞恶性肿瘤的临床经验表明，CART细胞有可能改变癌症免疫治疗的格局。然而，抗原阴性和抗原低的肿瘤变异体的出现表明，与所有抗癌药物一样，CAR可能需要组合方法来治愈大部分患者。在血液系统恶性肿瘤中，谱系来源的抗原以高水平表达并且可以被CAR有效靶向，而在实体瘤中，大多数可行抗原的表达水平较低且更加异质。重新设计CAR在较低抗原水平下的多特异性和活性将是一个重要的研究领域，因为社区试图增强CART细胞的效力以及它们可以提供具有临床意义的影响的疾病的广度。

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